从羊水中可成功构建胎儿上皮类器官，探索先天疾病的新前沿！|羊膜|扩张期|祖细胞|胎儿畸形

文章介绍2024年3月4日，英国伦敦大学学院大奥蒙德街儿童健康研究所的研究团队联合多家机构在期刊Nature Medicine（IF:82.8990）发表了一篇题为“Single-cell guided prenatal derivation of primary fetal epithelial organoids from human amniotic and tracheal fluids”的文章。#1摘要Abstract目前，组织特异性胎儿干细胞和原代类器官的分离与衍生主要依赖于终止妊娠的样本，这限制了胎儿发育和先天性疾病的产前研究。因此，需要构建新的患者特异性体外模型。若能在怀孕期间分离和扩增胎儿干细胞，无需组织样本或细胞重编程，将大有裨益。羊水（AF）是多个发育器官的细胞来源，通过单细胞分析，研究者表征了人类AF中的细胞特性，并成功分离出胎儿胃肠道、肾脏和肺部的活上皮干/祖细胞。这些细胞在培养后能形成克隆上皮类器官，表现出小肠、肾小管和肺的特征。AF类器官具有其起源组织的转录组学、蛋白质表达和功能特性。他们还从先天性膈疝胎儿的AF和气管液细胞中获得了肺类器官，这些类器官再现了疾病的一些特征。AF类器官的衍生时间与产前干预相一致，有望在临床相关发育阶段研究针对胎儿的个性化治疗工具和再生医学策略。#2研究方法Methods1. 采集人类羊膜液和气管液样本：研究团队从孕妇的羊膜液和新生儿的气管液中采集样本，用于分离和培养胎儿干细胞。2. 单细胞测序技术：利用单细胞测序技术对羊膜液和气管液中的细胞进行分析，以识别和分离出具有干细胞特性的细胞群。3. 建立原代胎儿上皮类器官：通过将分离的胎儿干细胞培养在特定的培养基中，形成原代胎儿上皮类器官，如胎儿肺、胃等。4. 分子生物学分析：对形成的类器官进行分子生物学分析，包括基因表达分析、蛋白质表达分析等，以了解其特性和功能。5. 功能实验：进行功能实验，如移植实验、药物反应实验等，验证类器官的功能和应用潜力。通过这些研究方法，研究团队成功地从人类羊膜液和气管液中分离出胎儿干细胞，并建立了原代胎儿上皮类器官，为研究胎儿发育和先天疾病提供了新的研究模型和方法。#3主要结果Results单细胞定位人羊水，研究组织特异性胎儿上皮祖细胞的存在在这项研究中，研究人员对人类的羊水（AF）进行了单细胞图谱分析，以研究组织特异性胎儿上皮祖细胞的存在。他们从12次妊娠中收集了AF样本，并使用荧光激活细胞分选（FACS）技术分离出有活力的核细胞。随后，他们进行了3'单细胞RNA测序（scRNA-seq）并使用Seurat v.4生成了UMAP。他们利用SingleR软件根据人类主要细胞图谱数据自动注释上皮簇，并通过泛上皮标记基因的表达证实了这一注释。为了验证蛋白质，他们使用流式细胞术确认了大多数有活力的AF细胞中存在上皮细胞粘附分子。图1 单细胞 AF 含量分析。a，左上图：羊水采样的图形表示。左下图：FACS图展示了用于收集活细胞部分的分选策略，这些细胞PI呈阴性，Hoechst呈阳性。中间图：UMAP展示了在妊娠中期和晚期获取的多个患者羊水样本的内容（n=12个生物学独立的羊水样本，跨越15-34个孕期；经过筛选后检查了33,934个细胞，分布在11个测序通道上）。橙色突出显示的是上皮簇，这是通过SingleR细胞标记包，使用人类原代细胞图谱数据集作为参考来识别的。右图：小提琴图显示了泛上皮特异性基因EPCAM、CDH1（ECAD）、KRT8、KRT10、KRT17和KRT19的表达水平（数据以每百万归一化计数（CPM）表示）。b，UMAPs显示了在上皮簇中选定上皮标记物的表达情况，这些上皮簇是在a中识别的。c，流式细胞术分析EpCAM（n=58,964个细胞）和ECAD（CDH1，n=38,389个细胞）在羊水活细胞分选中的表达情况；灰色代表未染色对照（n=34,045个细胞）。d，重新计算的UMAP，展示了在a中识别出的上皮簇，通过scGSEA将细胞归因于三种组织。e，对d中识别的细胞进行评分，以评估其是否含有适当的祖细胞相关基因。具有正评分的细胞在重新计算的该组织细胞UMAP中突出显示。分数也以小提琴图的形式绘制，确定了祖细胞的不同群体，阳性分数的阈值以红色标出。胎儿上皮人类原代 AFO 的生成在研究中，生成初级胎儿上皮人类羊水类器官（AFOs）涉及了几个关键步骤。首先，研究人员将来自人类羊水的活细胞接种在Matrigel液滴中，并在不含组织特异性信号的一般上皮培养基中进行培养。两周内，单个细胞开始增殖并自我组织形成3D类器官。接着，为了建立克隆系，研究人员挑选出单个AFOs，将其解离成单个细胞，并重新接种。这一过程使得研究人员能够从原始羊水样本中推导出多个克隆系。这些推导出的AFOs呈现出多种形态，能够扩增至第20代，并成功进行冷冻保存，显示出自我更新和长期培养的能力。此外，在89.7%的羊水样本中观察到类器官形成，平均形成效率为0.011%，这表明细胞具有形成类器官并自我组织成复杂结构的能力。通过遵循这些步骤，研究人员成功地从收集到的样本中生成了初级胎儿上皮人类羊水类器官（AFOs）。图2 生成原代胎儿上皮 AFOs。a，相衬图像显示来自三维培养的活羊水细胞的类器官形成，在第14天观察到不同形态的类器官（比例尺，200μm）。b，上图：AFOs在分离时（传代次数P0）的形成效率（每个活细胞的类器官数）和大小（类器官面积）（效率图n=26个独立的羊水样本，面积图n=197个类器官；两者均为中位数和四分位数）。下图：代表不同孕龄（GA）下类器官形成效率（每个活细胞的类器官数）的线性回归图。颜色和大小代表每个样本产生的总类器官数；虚线代表线性回归，R2=0.05，标准误（s.e.m.）以灰色显示。c，相衬图像显示了在P1、P5、P10和P20扩张过程中观察到的多个克隆AFO形态（比例尺，200μm）。d，在7-15天的培养过程中，每平方毫米形成的类器官数量在十个传代次数中进行了量化（n≥11个类器官，来自n=19个独立的羊水样本；中位数和四分位数；单因素方差分析（ANOVA）与多重比较）。e，两种观察到的类器官表型（紧凑型和囊性）的X射线PC-CT。比例尺，25μm。f，免疫荧光染色显示P3的AFOs中增殖标志物Ki67的表达和缺乏裂解型半胱天冬酶3凋亡细胞，细胞核用Hoechst复染（比例尺，50μm）。g，免疫荧光染色显示P3的AFOs表达上皮标志物EpCAM、ECAD和泛细胞角蛋白，同时缺乏间充质标志物PDGFRɑ的表达。免疫荧光染色还显示了AFO的极化，其特征是上皮紧密连接ZO-1存在于管腔表面，而基底外侧存在ITGβ4。鬼笔环肽复染强调了肌动蛋白丝（F-ACT）（比例尺，50μm）。h，无监督的主成分分析（PCA）图显示AFOs（三角形）形成了三个主要集群（来自n=23个羊水样本的n=121个类器官系）。这些集群与来自初级胎儿组织衍生的对照类器官（圆圈，n=20）存在共定位，这些对照类器官是从肺（青色）、小肠（紫色）、肾（绿色）、胎盘（黄色）、膀胱（橙色）和胃（红色）样本中产生的。i，从三个组织特性的代表性AFOs中产生的单细胞RNA测序（scRNA-seq）UMAP。通过SingleR细胞标记包识别的上皮细胞以橙色突出显示；KAFOs（1467个细胞，n=5名患者）、LAFOs（1966个细胞，n=4名患者）和SiAFOs（1576个细胞，n=2名患者）均显示在图中。SiAFO的特征和成熟度在研究小肠羊水类器官（SiAFOs）的特性和成熟过程中，研究者们进行了多项重要步骤。首先，他们通过在小肠特异性培养基中培养SiAFOs长达14天，成功诱导其成熟。在这一过程中，类器官呈现出更加明显的出芽结构，类似于小肠隐窝的组织形态。接着，利用免疫荧光染色技术，研究者们评估了成熟SiAFOs中特定标记物的表达情况，包括用于识别肠内分泌细胞的嗜铬粒蛋白A（CHGA）和用于标记杯状细胞的粘蛋白2（MUC2）。随后，通过定量逆转录PCR（RT-qPCR）分析，结合特定抑制剂处理，研究者们深入研究了成熟SiAFOs的基因表达谱，揭示了成熟过程中分子层面的变化。此外，功能性实验也被用来评估小肠刷状缘酶（如二肽基肽酶IV和糖苷酶）的消化活性，以检验成熟SiAFOs的功能能力。最后，通过肠道环状形成实验，研究者们探讨了SiAFOs在组织工程方面的潜力，观察了类似肠道结构的管状出芽结构的形成情况。图3 小肠 AFO 的特征和成熟。a，相衬图像描绘了SiAFO的扩张（比例尺，200 μm）。EdU检测显示增殖细胞定位于隐窝样结构底部（比例尺，50 μm）。b，RNA-seq散点图显示SiAFO中存在小肠标志物（n=2个独立生物样本，n=23条扩张线，n=6条成熟线，n=5个环，n=5个对照胎儿组织来源的小肠类器官）。c，用肠干细胞标志物OLFM4、肠细胞标志物KRT20和ITGβ4进行免疫荧光染色。溶菌酶细胞（LYZ）、脂肪酸结合蛋白1（FABP1）和E钙粘蛋白（ECAD）染色突出了杯状细胞和肠细胞（比例尺，50 μm）。d，SiAFO中OLFM4、LYZ和EdU的量化。e，扩展中代表性SiAFO的注释scRNA-seq UMAP（灰色；1,576个细胞，n=3个类器官线）和成熟中代表性SiAFO的注释scRNA-seq UMAP（橙色；1,666个细胞，n=3个类器官线）。f，成熟的SiAFO显示出出芽形态（比例尺，200 μm）。免疫荧光染色显示铬粒蛋白A（CHGA）阳性的内分泌细胞和粘蛋白2（MUC2）阳性的分泌细胞。用鬼笔环肽（F-ACT）和Hoechst复染显示类器官的管腔和细胞核（比例尺，50 μm）。g，二肽基肽酶IV活性的功能评估。h，二糖酶活性的功能评估。i，j，示意图（使用BioRender创建）（i）和相衬图像（j，顶部）展示了SiAFO环的自我组装和压缩（比例尺，插图中的200 μm、1 mm和500 μm；来自两个AFs的8个环）。环的相对周长随时间变化的量化。MicroCT 3D重构和整个SiAFO环的横截面描绘了管腔结构（j，底部）（比例尺，50 μm）。L，管腔。k，SiAFO环具有管腔和KRT20阳性的肠细胞，ITGβ4强调基底侧以及CHGA阳性的内分泌细胞。图中展示了SiAFO环中的LYZ阳性细胞、ZO-1阳性紧密连接、FABP1阳性肠细胞和MUC2分泌细胞，在隐窝样区域观察到增殖的Ki6阳性细胞（外部侧）（比例尺，50 μm）。CT，对照；PBS，磷酸盐缓冲液。KAFO 的特征和分化在研究中，对肾脏小管羊水类器官（KAFOs）的表征和分化涉及了多个关键步骤。首先，KAFOs经过长期培养，以支持其生长和发育，并通过相相衬图像监测其扩张和形态变化。其次，利用免疫荧光染色技术，标记了KAFOs中的增殖标志物（如Ki67），以揭示细胞活动和增殖情况。接着，通过批量RNA-seq分析，评估了KAFOs中广泛存在的肾脏标志物，有助于识别与肾脏发育和功能相关的关键基因表达。此外，免疫荧光染色还用于验证KAFOs中肾小体祖细胞标志物（如PAX8和LHX1）、远端小管/集合管标志物（如GATA3）、近端小管标志物（如LTL）以及其他指示肾脏上皮特性的标志物的存在。最后，通过功能测试（如菊粉通透性测定），评估了KAFOs的功能特性，这有助于了解类器官的屏障功能和通透性。通过这些表征和分化过程，研究人员能够识别并研究KAFOs的细胞组成、基因表达谱和功能特性，这不仅有助于我们理解肾脏发育，还为研究肾脏疾病和潜在的再生医学应用提供了有价值的模型。图4 肾小管AFO的特征和分化。a，相衬图像展示了KAFO的长期培养过程（比例尺，200 μm）。免疫荧光染色突出了增殖标志物Ki67（比例尺，50 μm）。b，批量RNA-seq分析显示KAFOs中存在广泛的肾脏标志物（n=19个独立生物样本，n=37个处于扩张期的细胞系，n=7个处于分化培养基中的细胞系，n=4个对照FKOs）。CD，集合管；DT，远端小管；LoH，亨氏袢。c，免疫荧光染色显示肾小体祖细胞标志物PAX8和LHX1的存在，用鬼笔环肽（F-ACT）进行复染，同时显示远端小管/集合管标志物GATA3、近端小管标志物LTL、ECAD和Ac-αTUB顶端纤毛呈阳性，进一步证实了KAFOs的肾上皮特性（比例尺，50 μm）。d，KAFOs中肾标志物PAX8、LHX1和GATA3的定量（n=6个独立生物样本，每个样本≥4个类器官）。e，对来自独立生物样本的n=7个KAFOs、n=3个FKOs和n=3个FLOs（作为阴性对照）进行了钾离子通道测定（计算平均荧光强度（MFI））。f，展示了未经处理和经EDTA处理的KAFOs的菊粉测定结果（比例尺，50 μm）；具有完整屏障完整性的类器官百分比定量（无菊粉-FITC摄取；n=5个独立生物样本）。g，KAFO在扩张期（灰色；1467个细胞，n=6个KAFO细胞系）和分化期（橙色；3559个细胞，n=3个KAFO细胞系）的注释KAFO单细胞RNA测序UMAP。NPC，肾小体祖细胞。h，免疫荧光染色显示RET蛋白在RET+和RET−KAFOs中的定位（比例尺，50 μm）。i，堆叠条形图表示RET+和RET−KAFOs中具有紧凑、囊性或混合（紧凑/囊性）形态的类器官比例（*P=0.0255，斯皮尔曼等级检验）。j，相位对比和免疫荧光（IF）图像突显了形态变化，以及分化过程中KAFOs中成熟肾标志物AQP2、SLC12A1和CALB1的表达（相位对比比例尺，200 μm；IF比例尺，50 μm）。k，左：在扩张（CT）和分化（DIFF）培养基中培养的KAFOs中CALB1阳性细胞的定量（n=4个独立生物样本）。右：基于b中呈现的RNA-seq图，分化后KAFOs（DIFF）与未分化对照（CT）的CALB1基因表达（n≥6个分化后的独立生物样本）。LAFO 的特征和区分在研究中，对肺羊水类器官（LAFOs）的表征和分化涉及了多个重要步骤。首先，通过培养扩张LAFOs，并利用相位对比图像监测其生长和形态变化，观察到其呈现出的囊性或紧凑结构，揭示了不同的形态学特征。其次，通过免疫荧光染色分析增殖标志物Ki67，评估了LAFOs内的细胞增殖活性。同时，利用批量RNA测序分析，探究了LAFOs的基因表达谱，发现了包括干细胞/祖细胞标记物、肺泡1型和2型细胞相关基因在内的多种肺脏标记物的表达。进一步，通过免疫荧光染色证实了肺干细胞/祖细胞标记物（如NKX2-1、SOX2）、基底细胞标记物（如P63）及其他肺上皮标志物的存在，并在分化过程中诱导了近端和远端肺分化的特定标记物的表达。此外，还进行了如菊粉通透性测定等功能性实验，以评估LAFOs的功能特性，并深入了解了其屏障功能和通透性。图5 肺AFO的特征和分化。a，相衬图像展示了LAFOs的扩张过程（比例尺，200 μm）。免疫荧光染色（IF）突出了增殖标志物Ki67的存在（比例尺，50 μm）。b，点图展示了LAFOs中代表性批量RNA测序基因表达（n=12个独立生物样本，n=21个未分化LAFOs，n=14个分化LAFOs，n=6个对照FLOs）。c，免疫荧光染色显示LAFOs中存在肺干细胞/祖细胞标记物NKX2-1和SOX2，以及P63基底细胞；鬼笔环肽（F-ACT）复染（比例尺，50 μm）。d，免疫荧光染色定量（n=6个AF样本，每个样本≥4个类器官）。e，注释的LAFOs在扩张期（灰色；1966个细胞，n=4个类器官细胞系）、近端（上方；3371个细胞，n=3个类器官细胞系）和远端分化期（下方；1351个细胞，n=3个类器官细胞系）的单细胞RNA测序UMAPs。f，近端分化LAFOs的免疫荧光染色显示纤毛蛋白Ac-αTUB的极化表达，以及纤毛细胞标记物FOXJ1的表达。该图板还展示了基底细胞标记物P63、KRT5的表达，粘蛋白5AC杯状细胞的存在，以及SOX2祖细胞的维持（比例尺，50 μm）。g，LAFOs在扩张期（CT）与近端分化期（DIFF）中FOXJ1阳性细胞的定量（n=5个独立生物样本，每个样本≥4个类器官）。h，小提琴图展示了近端气道标记物FOXJ1、TUBA1A、SCGB1A1、MUC5AC和KRT5在近端分化的LAFOs（DIFF）与未分化对照组（CT）中的基因表达情况，该图基于b中的RNA测序结果（n≥7个独立生物样本；中位数和四分位数）。i，透射电子显微镜（TEM）图像显示近端LAFOs内腔中存在纤毛（星号）（比例尺，2 μm）；横截面显示轴丝，包含外（红色箭头）和内（白色箭头）动力蛋白臂（比例尺，100nm）。j，远端分化LAFOs显示分泌表面活性物质的细胞（SFTPB），具有颗粒状和管腔分泌；Hoechst复染细胞核（比例尺，50 μm）。k，小提琴图展示了远端分化LAFOs（DIST DIFF）与扩张期对照组（CT）中表面活性物质相关基因的表达情况，该图基于b中的RNA测序结果（n≥7个独立生物样本；中位数和四分位数；NS，无显著差异；SFTPA1 *P=0.0107，SFTPA2 **P=0.0002，SFTPB *P=0.0168，SFTPD P=0.0028，Holm–Šídák多重非配对t检验）。l，左图：远端分化LAFOs的透射电子显微镜图像，显示管腔（*）和含有层状体的细胞（红色箭头）。右图：层状体的放大图像，显示多层膜结构。比例尺分别为1 μm和500nm。CDH 胎儿AF和TF类器官的特征描述研究人员对患有先天性膈疝（CDH）胎儿的羊水（AF）和气管液（TF）类器官进行了表征，涉及多个关键步骤。首先，他们从患有严重或中度CDH相关肺发育不全的胎儿中收集流体样本，特别是在胎儿内镜气管阻塞（FETO）手术期间，获得了AF和TF样本。接着，利用这些样本分别衍生出肺类器官，即CDH AFOs和肺TFOs（LTFOs），采用与对照LAFOs相同的协议，成功从CDH流体样本中形成了类器官。随后，CDH LAFOs和LTFOs被扩增至第10代，呈现出与对照LAFOs一致的形态，具有与非CDH样本相似的生长和结构特征。然后，通过RNA测序等技术进行基因表达分析，比较CDH AFOs和LTFOs与对照LAFOs的分子特征，从而揭示了与CDH相关肺发育不全相关的基因表达模式。最后，PCA分析证实了所有TF衍生类器官的肺身份，并展示了CDH LAFOs/LTFOs相对于对照LAFOs的聚类偏移，凸显了CDH来源肺类器官的独特分子特征。图6 从 CDH 妊娠中生成 LAFOs 和 LTFOs，并对其进行分化和特征描述。a，CDH妊娠中AF/TF采样的示意图。b，c，相衬图像展示了CDH LAFOs（b）和LTFOs（c）从P0到P10的形态（比例尺，200 μm）。免疫荧光染色面板突出了CDH类器官中的增殖标志物Ki67、肺干细胞/祖细胞标志物NKX2-1/SOX2和基底细胞标志物P63（比例尺，50 μm）；细胞核用Hoechst复染。d，类器官形成效率（每活细胞中的类器官数，n=16个CDH AF和n=7个CDH TF独立样本）以及CDH AFOs与CDH TFOs在分离时的面积（n≥91个类器官）。条形图展示了CDH LAFO/LTFO的形态与对照的形态（囊性、紧凑型、混合型；n≥3个独立生物样本；中位数和四分位数；NS，无显著差异；*P=0.0477，双向方差分析，多重比较）。e，免疫荧光染色量化结果（n=7个CT AF，n=4个CDH AF，n=4个CDH TF独立样本，每样本≥4个类器官。f，免疫荧光染色显示CDH LAFOs/LTFOs中的SOX9（比例尺，50 μm）。g，点图展示了CDH TFOs（29-34周胎龄，四名患者）和AFOs（28-34周胎龄，八名患者）以及胎龄匹配的对照LAFOs（27-34周胎龄，三名患者）中的肺相关标志物。h，小提琴图展示了CDH LAFOs/LTFOs在FETO前后的SOX9表达情况，与胎龄匹配的对照LAFOs进行比较。i，火山图展示了CDH类器官与胎龄匹配对照在FETO前后的差异表达基因（DEGs）。显著的（P<0.01）肺相关标志物已标记。蓝色点表示统计学上显著下调的基因，红色点表示统计学上显著上调基因。LFC，对数倍数变化。j，免疫荧光染色显示CDH类器官在FETO前后的前表面活性蛋白C（proSFTPC）（比例尺，50 μm）。k，透射电子显微镜（TEM）图像显示，近端CDH LAFOs具有纤毛（*），这通过Ac-αTUB和纤毛转录因子FOXJ1的免疫荧光染色得到证实；细胞核用Hoechst复染（比例尺，500nm TEM，50μm IF）。条形图展示了FOXJ1的量化结果（n=5个CDH和n=5个对照独立生物样本）。l，纤毛摆动频率（CBF）的量化结果（Hz；每类类器官至少5个视频，n=5个CDH类器官系，n=4个非CDH对照LAFO系）。m，透射电子显微镜成像显示远端化CDH类器官中存在层状体（箭头）（比例尺，1μm）。免疫荧光染色显示远端化CDH LAFOs/LTFOs中的表面活性蛋白B（SFTPB）；细胞核用Hoechst复染（比例尺，50μm）。n，CDH LAFOs/LTFOs在扩展（左；1877个细胞，n=6个类器官系）、近端（中左；3843个细胞，n=5个类器官系）和远端分化（中右；6090个细胞，n=5个类器官系）时的单细胞RNA测序（scRNA-seq）UMAP注释图。右侧显示了不同类器官身份之间的细胞类型堆叠条形图（%）。总结本文研究通过单细胞技术成功从人羊膜液和气管液中分离和培养出原代胎儿上皮类器官（AFOs和TFOs），为产前诊断和再生医学提供了新的可能性。研究发现，CDH患者的LAFOs和LTFOs在形态学和基因表达上与对照组LAFOs相似，但在基因表达水平上显示出与CDH相关的特定分子特征。此外，研究还展示了CDH LAFOs和LTFOs的增殖能力和分化潜能，为CDH相关肺发育异常的研究提供了重要线索。这些发现为产前疾病建模和个性化治疗提供了新的研究平台，有望推动先天疾病的早期诊断和治疗。参考信息：Single-cell guided prenatal derivation of primary fetal epithelial organoids from human amniotic and tracheal fluids.Nat Med. 2024 Mar 4. doi: 10.1038/s41591-024-02807-z.PMID: 38438734.胃癌类器官培养图鉴【Nature Protocols】系列：如何培养血管类器官（上）“类器官”斩获国自然重点项目，首例视网膜类器官移植开创再生医学领域新篇章！国自然基金-类器官项目申报思路解析（含2023年获批项目实例！）【国际专访】Jiang教授：类器官模型不会取代体内模型，但有助于简化药物开发